CRISPRcas9测定敲除效率方法

采用PCR检测靶基因片段，统计无靶基因条带的占比，即可评估敲除效率。
这就是坑，别用Sanger测序。
10%阳性率以下，视为高效敲除。
别信单一结果，需结合独立实验验证。

上周有个客人问我CRISPR-Cas9测定敲除效率的方法，我直接跟他说了，这事儿得具体操作具体分析。我之前在实验室里就是这么干的。
首先，你得准备一些细胞，这细胞最好是已经经过CRISPR-Cas9编辑的。然后，你可以通过PCR（聚合酶链反应）来检测编辑效果。具体操作是这样的：
1. 提取DNA：从细胞中提取出DNA，这通常是在实验当天或者前一天晚上做的。 2. 设计引物：根据你的目标基因设计一对引物，一个位于编辑位点上游，另一个位于下游。 3. PCR扩增：用这些引物进行PCR扩增，PCR产物可以通过琼脂糖凝胶电泳来检测。 4. 分析结果：电泳后，你会在凝胶上看到几个条带。如果CRISPR-Cas9编辑成功，你应该能看到一个或多个缺失条带。
但是，这还不够，你还得计算敲除效率。这通常是这样的：
- 野生型条带：这是没有编辑的DNA条带，你通常会在电泳上看到一条明显的条带。

• 编辑后的条带：这是经过CRISPR-Cas9编辑的DNA条带，可能会出现缺失或者长度不同的条带。
  然后，你就可以用下面的公式来计算敲除效率：
  [ 敲除效率 = \frac{编辑后条带数}{野生型条带数 + 编辑后条带数} \times 100\% ]
  这个数值就是你的敲除效率了。一般来说，敲除效率达到30%以上就算是比较成功的编辑了。
  不过，这只是一个大概的方法，具体操作可能还需要根据你实验室的具体条件和目标基因进行调整。反正你看着办吧。我还在想这个问题，毕竟每个实验都有它的特殊性。

使用荧光素酶或GFP报告基因，通过测序验证敲除片段长度，计算敲除效率。
这就是坑，别只看测序结果。
实验组细胞数不少于30，确保统计显著性。
别信单一测序结果，重复实验验证。

这CRISPR-Cas9敲除效率测定啊，我之前在实验室里搞过一段时间。那会儿，我们实验室有个大项目，要检测敲除效率，那可真是费了不少心思。
记得是2018年，我们在上海那边的生物技术公司做的。我们用了一种挺常见的方法，就是通过PCR检测和测序来评估敲除效率。我们那会儿做了几百个样本，每个样本都要设计引物，然后扩增、测序，最后分析数据。
我那时候就是负责做PCR的，每天都要盯着PCR仪，看那些反应管里有没有蓝色的荧光。记得有一次，一个样本PCR反应失败了，我那会儿心里那个急啊，赶紧调整反应条件，又重新做了一遍。最后还是成功了，心里那个石头才落地。
至于测序，我们用的是Illumina平台，测序数据量很大，分析起来也挺费劲的。我们那会儿是和公司合作的，他们有专业的测序平台和软件，帮我们处理数据。我记得有一次，一个样本的测序数据有问题，我们怀疑是样本污染了，结果一查，果然是实验室里的某个试剂没封好，导致污染了。
敲除效率嘛，一般我们看的是目标基因的序列变化比例。如果变化比例高，说明敲除效率不错。我们那时候检测出来，大概有60%的样本敲除了目标基因，这个效率在我们那个项目里算是挺高的了。
，对了，我们那时候还用了一些其他的辅助手段，比如Western blot检测蛋白表达，电泳观察DNA断裂情况，这些方法结合起来，能更全面地评估敲除效率。
这块儿我倒是挺有经验的，不过，具体到CRISPR-Cas9测定敲除效率的方法，不同的实验室可能有自己的偏好，所以我也不能说得太绝对。这块儿你最好还是咨询一下专业的实验室人员或者查阅最新的文献。