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卿弦季鸢
2025-03-19 14:10:33- 提取目标基因序列
- 设计并合成sgRNA
- 将Cas9蛋白与sgRNA结合
- 将Cas9-sgRNA复合物转入细胞
- 靶向DNA断裂
- DNA修复
- 基因编辑成功
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城仲梧
2025-11-22 13:28:19- 设计目标基因序列
- 构建gRNA表达载体
- 转染细胞
- 筛选编辑细胞
- PCR验证
- 测序验证
大白话：先设计个要改的基因序列，然后做个小工具（gRNA），把工具送进细胞里，筛选出改过的细胞，再用PCR和测序确认改对了。
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杀戮灭人性
2026-01-19 10:26:45- 目标基因定位：2023年，在基因组上确定需要编辑的位置，如chrX:1000000-1000100。
- 设计引物：设计两个20-30碱基的引物，确保它们能够与目标DNA序列特异性结合。
- 酶切：用限制酶（如BsmBI）切割双链DNA，形成粘性末端。
- 引物延伸：在DNA聚合酶的作用下，以引物为模板，延伸DNA序列。
- 聚合酶链反应（PCR）：通过PCR扩增含有Cas9蛋白结合位点和sgRNA结合位点的DNA片段。
- 重组：将Cas9蛋白和sgRNA与DNA片段结合，形成CRISPR-Cas9复合体。
- 目标DNA切割：CRISPR-Cas9复合体识别并结合到目标DNA序列，Cas9蛋白切割双链DNA。
- DNA修复：细胞内的DNA修复机制（非同源末端连接或同源重组）修复切割的双链DNA。
- 验证：通过测序或PCR等方法验证编辑效果，如2023年，确认目标基因在第1000020位发生了G到A的突变。
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